Изолиране на фитопатогенни гъби в чисти култури

Както посочва Н. А. Наумов (1937), наборът от методи за изолиране и култивиране на гъби варира в широк диапазон в зависимост от целта на изследването. Концепцията за експерименти обаче се вписва в една система. Преди да се получи изследваната гъба в чиста култура, е необходимо да има спороносна тъкан или мицел, без инфекция с епифитна микрофлора, което понякога изкривява картината, усложнява идентифицирането и изолирането на засегнатите тъкани.

Един от най-простите методи за получаване на мицел или спорулационни органи (включително редица задължителни паразити) е използването на т.нар. мокри камери. Обикновено се използва за тяхното производство. петри или Кох. Дъното на чашките и вътрешната повърхност на капаците са облицовани с кръгове от филтърна хартия с подходящ диаметър, стерилизирани при температура 110 ° С в продължение на два часа и навлажнени със стерилна вода. Малки части от изследваните тъкани в количество от 3-10 проби след повърхностна стерилизация се поставят върху дъното на чашките директно върху филтърната хартия равномерно по повърхността й..

Повърхностната стерилизация на части от болните тъкани може да се извърши с помощта на пламъка на алкохолна горелка (пламък), струя вода или специални химикали. Методът за повърхностна стерилизация на естествен субстрат е подходящ за дърво, корени, семена или плодове. Колкото по-обемният предмет се стерилизира, толкова по-задълбочено и по-дълго е възможно да го затоплите, без да се страхувате за жизнеспособността на мицела вътре в тъканите.

Понякога е необходимо да се изолира патогенна гъбичка от полуразграден материал или от калните части на растението (перитерапия на краста върху паднали листа и др.). В този случай тестваният обект се поставя върху сито и се измива в продължение на няколко часа под течаща вода.

Впоследствие материалът, взет за изследване, допълнително се почиства и дезинфекцира от повърхността чрез потапяне в едно от следните вещества: 96- или 50-ти алкохол за 2-3 минути - разтвор на живачен хлорид (0,1-и) с излагане от няколко секунди до три минути- 0,5-1,0-ти разтвор на калиев перманганат (до 20 минути) - избистрен разтвор на белина (1-ва) - 0,1-1,0-ти разтвор на бромна вода (няколко секунди) или в разтвори на други дезинфектанти последвано от измиване в стерилна вода. За целта може да се използва формалинов разтвор 1: 300, последвано от изтриване на обекта в съда с неговите пари от 30 минути до 2 часа.

Изследванията на гъбички, развиващи се във влажни камери, трябва да се извършват директно в чашките при малко увеличение на микроскопа в предавана или отразена светлина..

След появата на спорулация или признаци на развитие на мицела, той се субкултивира върху хранителна среда от агар директно в епруветка за коса агар или преди това върху агарова среда, разлята в чаши на Петри. Задължителните паразити се отглеждат върху живи растения или специални среди.

За по-нататъшна работа е много важно да се пречисти културата. Това се извършва чрез окабеляване на бара, разреждане в стерилна вода или използване на епруветки.

1. Малко количество от гъбата се пренася върху културния контур и се нанася върху повърхността на агара в чаши на Петри. С удължаването на удара спорите се разделят все повече и повече, докато в резултат на това отделни колонии възникнат от няколко или единични спори.

2. Спората на инокулум се поставя в епруветка със стерилна вода (10 ml), след това определено количество суспензия (например 1 ml) се прехвърля със стерилна пипета в епруветка с 9 ml стерилна вода. Използва се прясна стерилна пипета за смесване на течността и прехвърляне на 1 ml от нея в следващата епруветка, съдържаща 9 ml стерилна вода. Развъждането продължава при нужда. Такова десетхилядно разреждане има някои предимства пред окабеляването на тире. В крайното разреждане към разтопения агар се охлажда 1 ml от споровата суспензия, охладена до около 40 ° С..

3. Вземете пет епруветки от съответната агарова среда, разтопете я и охладете до + 45 ° С. След това малко количество спори се въвежда в една от епруветките - тръбата се превърта между дланите на ръцете и съдържанието се излива в чиния на Петри. Празната епруветка отново се напълва от друга епруветка с разтопена среда, превърта се между ръцете и се излива във втора чаша. Тази процедура се повтаря с останалите три епруветки..

При провеждане на теоретични изследвания или анализ на популация от всякаква географска форма става необходимо да се получи култура от един спор. Почти моноспорната култура на много гъби се получава по следните начини.

1. Слаба суспензия на спори се приготвя на стерилна стъклена стъкла в стерилна вода чрез потапяне на калциниран навлажнен контур в спорулираща култура. Тази суспензия на спори е набраздена по една линия в чаша на Петри върху много тънка агарова плоча, приготвена във варена вода и съхранявана при + 24 ° C. Ако това се прави в 16-17 часа, тогава на 9-10 часа на следващия ден обикновено се наблюдава началото на покълването и готовността на спорите за изолиране.

Когато работите с бинокъл (стереоскопичен микроскоп), чашата на Петри се премества по линията на маркировката и се избират подходящи кълнове. Подходяща игла прави изрез от хангар около 2 мм около спората. Този квадрат и зоната непосредствено около него се проверяват под малко увеличение на биологичен микроскоп, за да се гарантира, че има само една спора.

След това блокът на врабския агар се прехвърля с помощта на стерилна игла под бинокъл в агарова плоча или епруветка.

2. Хранителната среда се изсипва на тънък слой в стерилни чашки на Петри, след това се взема епруветка със стерилна вода и в нея се въвежда малко количество от тестовите гъбички и се разклаща старателно във вода. След това 4-5 капки от суспензията на спорите се вземат с метален контур и се прехвърлят върху стъклен предмет. Под микроскоп се броят броят на спорите във всяка капка. Ако спад завърши средно п спора, стерилна вода се добавя към епруветката, за да увеличи обема си в п+1 път.

Освен това можем да предположим, че в една капка ще има средно един спор. След това се вземат 3-4 капки от епруветка с разредена суспензия от спори и се прехвърлят в чаши на Петри върху агарова среда. Капките трябва да бъдат отделени една от друга на сравнително голямо разстояние. Под микроскоп проверете броя на спорите, попадащи във всяка от тези капки. Гледането е от дъното на чашата, което е внимателно обърнато за това. В същото време тези се избират от капчиците, в които се съдържа една спора, и се маркират върху стъклото с восъчен молив. Колониите, получени в чаши на Петри, се проверяват в наклонени тръби от агар.

Понякога капка суспензия, съдържаща една спора, се поставя върху стерилна чаша в чаша на Петри и към нея се прибавя парче агарова среда - след като мицелът на гъбата се обрасне с него, културата се прехвърля в епруветка или чаша на Петри.

3. Хансен (H. R. Hansen, 1926) използва тънки стъклени капиляри, спуснати със суспензия от спори в топла агарова среда. След това тези капиляри се изследват микроскопично и се нарязват на парчета, всеки от които съдържа по една спора. След това такива парчета се подлагат на повърхностна стерилизация и се поставят в агарова плоча.

Можете да използвате други методи за получаване на моноспорни култури, които са посочени в литературата (например методът на "суха игла" Хана и други). Така че, за да се получи моноспорна култура от редаоспори, ръждивите зърнени култури се отърсват върху сух стъклен слайд. След това с края на изтегления стъклен прът се отделя една спора под бинокъл или с малко увеличение на микроскопа. Краят на пръчката се избърсва предварително с памучна вата, навлажнена с метилиран спирт или алкохол. Избраната спора се прехвърля в капка вода в лист на растенията. Такива манипулации се извършват около 200 пъти, като се има предвид, че процентът на оцеляване обикновено е 6-10.

При изолиране на моноподулна култура на гъбата се извършва предварително размножаване на популацията от ръжда, така че по листата да се образуват единични уредопустули. За това се използва малко количество спори за инокулация..

След получаване на първоначалните пустули в резултат на моноспорна или монопускулна култура на гъбата, те започват да размножават спори в тях върху определени сортове, повтаряйки процеса на възпроизвеждане на растенията от добре развити уретроподи 2-3 пъти. В резултат на това се натрупва достатъчно количество инокулум за последваща работа с него.

Изолирането на чистите култури от различни органи и тъкани има свои собствени характеристики. При повърхностно увреждане на плода външният повреден слой се изстъргва и мицелът се покълва във влажна камера, последвано от повторно размножаване на колонията върху агарова среда. Преди това засегнатата повърхност се измива старателно със стерилна вода..

Когато се изолират културите от вътрешните части на плода, те се измиват старателно, дезинфекцират в живачен хлорид (1: 100) в продължение на 5 минути и след това отново се измиват в стерилна вода, парчетата плодове, нарязани от вътрешни тъкани със стерилен скалпел, се поставят върху хранителен агар.

Когато изолирате патогени, които причиняват външно увреждане на корените, използвайте описаната техника за плода. При вътрешни лезии корените се измиват старателно, пламват и след това се правят напречни или надлъжни разрези. Получените малки парченца вътрешна болна тъкан се покълват върху среда за култивиране на агар..

Изолирането на гъби от листа, венчелистчета и други деликатни органи е свързано с известни трудности, тъй като в този случай почти напълно трябва да изоставим повърхностната стерилизация с помощта на химикали, които могат да повлияят на мицела на патогена в мезофила. За да увеличите точността и надеждността на селекционната работа, трябва да използвате най-малките възможни части от тъканите, като същевременно увеличавате техния общ брой.

Гъбите, които заразяват кора и дървесина (трахеомикоза, гниене, некроза), могат да бъдат изолирани директно от засегнатата тъкан чрез поставяне на повърхностно стерилизирани парчета или резени върху хранителни среди или от спори и мицели, получени във влажна камера. Дървесината и кората трябва да са свежи, тъй като гъбички от мухъл се развиват в застояли екземпляри, които запушват реколтата..

Засегнатата дървесина се дезинфекцира чрез потапяне в продължение на няколко минути в 95% алкохол или 0,5% разтвор на калиев перманганат, последвано от пламване. След това повърхностните части на пробата се нарязват със стерилен скалпел или микротом, а от вътрешната страна се изрязват плочи с дебелина от няколко микрона до 5-10 мм и се прехвърлят в хранителна среда.

Когато се изолира културата от плодовите тела на хименомицетите, първо се нарязва повърхностният слой и от вътрешната страна на плодоносителя се изрязват малки парченца с диаметър 4-5 мм и се потапят наполовина в хранителен агар. Тогава развитият мицел се прехвърля в наклонен агар.

За да се изолира ендогенен мицел от младите разсад, засегнатите части не се стерилизират, а само се измиват, за да не се убие - материалът се усвоява леко и се поставя върху хранителен агар или във влажна камера - появяващият се мицел бързо се отделя, опитвайки се да предотврати растежа на сапрофитни микроорганизми.

По-старите разсад се дезинфекцират в 0,5% разтвор на калиев перманганат, промиват се с вода и се поставят във влажна камера, откъдето развитият мицел се прехвърля в хранителна среда. Възможно е също така да се използват участъци от стъблото, които се поставят върху агар за покълване на мицела на патогенни гъби.

Микрофлората на болните семена обикновено се анализира след нейното развитие в културата върху хранителна среда (М. М. Самуцевич, 1931 г.). За целта се взема обща проба от партида семена от различни места, преброяват се 200 семена и се поставят 25 броя в чаши на Петри върху агарова среда.

При определяне на повърхностната инфекция семената не се стерилизират; за установяване на дълбока инфекция се съхраняват в калиев перманганат (0,5) за 2-3 минути или се потопят в чист алкохол за 1 минута.

В някои случаи санираните семена се нарязват на две части със стерилен скалпел. Силно мумифицираните семена се инкубират предварително върху филтърна хартия, навлажнена със стерилна вода, след изсушаване и пламване се поставят в чаши на Петри. Когато се появи спорообразуването на патогена, те се прехвърлят в наклонен агар.

Когато се изолира чиста култура, гъбите се отглеждат предимно върху слабо подкиселена агарова среда или желатин (Н. А. Наумов, 1937). По време на първоначалната изолация на патогена не може да се използва течна или силно навлажнена среда, тъй като това допринася за развитието на сапрофитни микроби. Освен това не трябва да сеете патогенни гъби върху твърда хранителна среда: ориз, картофи, хляб и други продукти.

За идентифициране на патогени, които персистират в почвата, за целите на последващата им изолация се вземат проби от характерни почвени разлики (подзол, чернозем, серозем и др.) На различни дълбочини от определени култури и др. При вземане на проби след това почвеният участък е стерилен. инструментът отделя желания слой, от който се взема проба от 10-20 g, поставя се в стерилна чиния или плик. Препоръчва се да се вземе почвата от горната стояща (до 3 см) и по-дълбока, на нивото на местоположението на основната маса на корените. За пълно характеризиране на сайта е необходимо да се получи информация за предишни култури и киселинност на почвата (pH) за три години.

При проучване на разпространението на инфекцията в полето почвените ями се изкопават на всеки 5 м в еднаква зона; за разузнавателни проучвания са достатъчни 5-10 почвени ями на секция..

Събраната почва се изсушава няколко дни до сухо на въздух състояние в хартиени пликове, смачква се и се поставя върху хранителна среда от агар с помощта на стерилна шпатула, скалпел и други инструменти. Всяка проба (10–20 g) се разпределя в 6–7 чаши на Петри, след това съдовете се съхраняват в термостат при температура 20–25 ° С и се преглеждат периодично. Тъй като гъбичните колонии се развиват, те се прехвърлят в наклонен агар в епруветките. Наличието на изолирани гъбички се определя по конвенционални методи. След 7-8 дни от началото на растежа на колонията, чашките стават неподходящи за скрининг на гъбички поради замърсяване на околната среда от сапрофитни микроорганизми.

Изследването на почвените гъби-микромицети е възможно чрез изолирането им в чиста култура или с помощта на метода на „разрушаване на плочи“, почвени микрокамери, педоскопи от много тънко стъкло и други техники.

Изолирането на микроорганизми, включително фитопатогенни гъби, в жизнеспособно състояние от вода и въздух е област на специални изследвания. Съществуват различни методи за анализ с помощта на пробоотборници, автоматични обемни и инерционни спорни капани (Ф. Грегори, 1964 - Ю. П. Бочков, А. И. Воронова, В. Ф. Думски, 1966 - А. И. Клочко, 1969 и др. )..