Методи за инокулация на растения

Преди да продължите с инокулацията на растенията, те трябва да бъдат подготвени. Те трябва да са без инфекции, очевидно здрави. За това експерименталните растения се отглеждат най-добре от здрави семена в оранжерия или отглеждаща се къща в саксии (цветни саксии), пълни с почва без инфекция. Семената преди сеитбата се дезинфекцират с конвенционални дресинг и почвата се автоклавира под налягане 1-2 атм.

При отглеждане растенията се поливат без намокряне на повърхността на листата и стъблата (водата се излива директно върху почвата или през специално поставени тръби). Ако е възможно, изключете външна или случайна инфекция, предавана от насекоми или през въздуха.

Ако експерименталните растения в оранжерийния експеримент не могат да бъдат получени от семена, растенията, които растат в диво състояние, се вземат и трансплантират в саксии, след което се съхраняват в оранжерията за поне един (за предпочитане 1,5-2,0) инкубационен период на болестта причинени от изследваната гъбичка. Практически за това 7-10 дни са напълно достатъчни.

При инокулиране на растения с гъби на полето е необходимо предварително да изолирате определените надземни органи от околната среда с остъклени дървени рамки, хартиени капачки, найлонови торбички, стъкло за прилеп или стъклени лампи - последните се връзват на колове, а горните и долните отвори се затварят с памучни тампони , Такава предварителна изолация за период от 1-2 инкубационни периода е необходима, за да се провери наистина здравословното състояние на експерименталните растителни органи. Освен това във всички случаи се стремят да гарантират, че изолираните растения или техните органи се развиват нормално, не са етиолирани, хлоротични, провиснали и т.н..

Възможно е да се провеждат експерименти върху отрязани части от растения, потопени във вода, в хранителен разтвор, както и върху отделени листа, поставени в разтвор на бензимидазол.

Методите за инокулация на растенията са доста разнообразни и зависят от биологията на гъбата и ролята на инфекцията в патогенезата на заболяването, както и от целите на изследването (проверка на патогенността на щамовете, оценка на устойчивостта на сортовете и др.). Помислете за редица техники за инокулация, които са сравнително добре изпитани и могат да бъдат препоръчани при практическа работа..

Инокулацията на растенията може да се извърши както от патоген, отглеждан върху изкуствена хранителна среда, така и от естествена популация от гъбични спори. В зависимост от задачата се използват различни инокули - мицел, спори, събрани от един сорт растение гостоприемник или представляващи географска популация и др..

При избора на метода на инокулиране се взема предвид производителността на труда, тъй като често се оценяват хиляди разновидности. Методите и времето на изкуствената инфекция са максимално близки до естествените. Във всички случаи се създават условия, които са оптимални за растежа на патогените (температура, влажност). Броят на инокулираните растения трябва да бъде най-малко 10 със задължителен контрол.

Редица болести (прашна смола от пшеница и ечемик, ръж ерго, хелминтоспориоза на ечемик и овес, жълта ръжда на пшеница и др.) Се характеризират с проникване на инфекция през цветя и яйчници. В този случай инокулацията се извършва чрез прилагане на сухи спори или суспензия на гъбични спори в цветя и яйчници. Например, К. К. Хохряков (1969 г.) сочи, че най-простият метод за инокулиране на пшеница и ечемик с прахообразна смола е пръскането на хламидоспори на причинителите на болестта по време на цъфтежа на зърнени култури от марлеви торбички или нарязване на засегнатите уши.

В. И. Кривченко (1963) модифицира вакуумния метод за инокулиране на пшеница с патогена на замърсяването, като използва специално устройство, състоящо се от цилиндър, в който са поставени ушите, останали върху лозата. Този цилиндър има две изходни тръби, едната от които е свързана към помпите, а другата служи за подаване на въздух. Отдолу, чрез специална вакуумна захващаща тапа и маркуч, се подава суспензия за спори (0,2 g спора на 0,5 l вода). Същността на метода е, че като изпомпва от цилиндъра с уши въздух, вода със спори навлиза там. След подаване на въздух суспензията се връща обратно в съда. За получаване на надеждни данни е достатъчно да се зарази 6-10 уши от един сорт, а при оценяване на семейства и линии от хибриди, най-малко три уши.

Е. Е. Гешеле (1964 г.) разделя методите за инокулация на кал от смъртен камък на две групи: индивидуална инфекция на цветя и цялото ухо. В първия случай един горен и два долни колона се нарязват с ножица, а средните цветя се отстраняват от останалите с пинсети. След това се отваря всяко цвете и се въвеждат спори с пинсети. Този метод има редица модификации. По-специално, можете да заразите цвете със специална пипета с круша. Във втория случай материал, съдържащ инфекциозното зацапване, се прилага върху здраво ухо, след като преди това е направил разрези на нивото на шиповия зъб.

Ечемиковите цветя се инокулират с конидии на причинителя на ивичеста хелминтоспориаза с помощта на вакуумно устройство в периода, когато шипът все още не е напуснал тръбата, само върховете на авен.

Цветовете на плодовите култури се заразяват с гъбички от рода Monilinia, чрез прилагане на сухи конидии с навлажнения край на иглата върху стигмата на вредителя. След това цветята се напръскват с вода от бутилка със спрей и върху тях се поставя марлен изолатор, напоен с вода, който за ден се покрива с пластмасов филм. В южните райони, освен това, инокулираните съцветия неясни - те правят същото, когато са заразени с уши.

Инокулираните плодови клони се изолират по същия начин като цветята. Ако се правят експерименти върху изрязани издънки, след изхвърляне на инфекцията върху листата, издънките се поставят във влажни камери, изработени от стъклени капачки, облицовани с мокра филтърна хартия отвътре в продължение на 24 часа при оптимална температура.

Когато инфекциозните агенти се прилагат върху листа, стъбла и други органи на растенията, като правило се използва суспензия от спори на патогени (конидии). Восъчното покритие на повърхността на листата затруднява проникването на гъбичките, така че се отстранява преди инокулация, като пропуска листа да преминава между мокри пръсти. Материалът, съдържащ инфекцията, като правило, се прилага върху долната страна на листа под формата на капка водна суспензия от спрей или разтривайте инокулума над листа със скалпел. Понякога се използват сухи спори, които се нанасят върху навлажнени листа със стерилна четка..

За изкуствено заразяване на листа директно върху растенията могат да се използват влажни камери с малък обем под формата на целофанови чаши (диаметър 20 мм), притиснати по краищата с еластична пружина (метод на М. С. Дунин).

Инокулираните растения за определен период от време (12, 24, 48 часа) се поставят във влажна камера, за да се осигури по-пълна инфекция. На полето това се постига чрез прилагане на спорна суспензия в облачни дни или вечер, особено ако се очаква роса.

Инфекциозният материал от зърнената ръжда обикновено се приготвя два часа преди прилагане върху растенията. За целта вземете 200-300 засегнати листа, потопете ги във вода (0,5-1 л) и отмийте от тях уредоспорите. Около 150 литра суспензия се изразходват за 150-200 м2 сеитба (Л. Ф. Русаков, 1926). В стационарни условия инокулумът се приготвя предварително в оранжерията или върху специални култури. За заразяване на парцелите - разпространители на ръжда, трябва да се вземат 5 mg редадоспора на 1 m2, като се напръскват заедно с талк в съотношение 1:30 или 1: 100. При непрекъснато инокулиране на 1 м2 се консумират 2 mg жизнеспособни уредоспори в случай на последващо покриване на растения с филм и 20 mg без мокра камера (К. М. Степанов, 1966).

Изкуственото заразяване на растенията с ръждиви базидиоспори (например линейни или кафяви) се извършва във влажна камера. Вземат се части от растения с развити телетоспори и се поставят над инокулираното растение по такъв начин, че докато узреят, базидиоспорите падат върху повърхността му.

Има съобщения за възможността за инокулиране на патогени на пирикулариаза и брашнеста мана с отделни листа от зърнени култури, поставени във влажни камери, както и малки кръгове от живи листа (с диаметър 12-14 мм) на тютюн с гъба Peronospora tabaciпи. В същото време те се поставят в чаши на Петри, дъното на които е облицовано с три слоя филтърна хартия, наситена без излишък с хранителен разтвор от следния състав (в g на 100 ml вода): калиев и натриев тартарат (KOSO - CHON - CHON - COONa) - 0,5- K2NRO4 - 0,1 - KNO3 - 2,0 - Co (N03) 2 - 0,06 - KCl - 0,03 - MnO4 - 0,001 и Mg04 - 0,5 (Isard, 1960).

При изучаване, например, облигационни паразити от дървесни видове, се използват специални методи. При работа с вокалуметични гъбички, които причиняват деформация на плодове и клони, издънките с признаци на повреда, отрязани от болни дървета, се поставят в съдове с вода, за да затворят аскоспорите, които са покрити с широка стъклена капачка. Под ръба на качулката се поставят уплътнения с височина около 10 см за достъп на въздух. След 1-2 дни върху засегнатите органи се появява мусурална спорулация на гъбата. Образуваните аскоспори се прехвърлят със стерилен скалпел в експериментални здрави растения, в яйчници или ивици, които започват да се развиват. В същото време везните се разкриват насилствено. Използват се и други специални техники, базирани на биологията на патогените, целите на експеримента и възможността инфекция да проникне при определени условия (Geshele, 1971).

При работа с причинителя на граховата аскохитоза, съгласно методологията на Държавната комисия за тестване на сортовете, инокулумът се получава в епруветки върху наклонен агар. От една епруветка с гъбична култура се приготвя суспензия, като се разклати в 1 литър вода. Освен това, средно 40-50 конидии на патогена трябва да се съдържат в една капка течност. На 1 м2 сеитба се консумират 2 л суспензия.

Семената могат да се инокулират сухи или мокри. Замърсяването на семената се практикува при изследване на твърда смола от пшеница. В същото време се изразходват 1 кг семена за 1 кг спори, в зависимост от очакваните метеорологични условия по време на сеитбата и през следващите дни. Когато времето не е благоприятно за разливане на смърч, натоварването с инфекция се увеличава. Оптималните условия се считат за температурата на почвата на дълбочината на семената 6 -10 ° С. Ако трябва да се тестват малки партиди семена, те се опрашват с прекомерно количество спори и преминават през сито. За да се създаде необходимия инфекциозен товар, семената на ечемика и овеса трябва да бъдат отстранени от филми, а Е. Е. Гешеле (1964 г.) препоръчва да се отстрани само онази част от филма, която покрива ембриона. В други случаи семената се разпръскват с тънък слой върху плътна повърхност, напръскват се със спорна суспензия, държат се във влажна камера. Семената от ечемик и овес също успешно се инокулират със смърч чрез потапяне в спорна суспензия. За 100 g семена се приготвят 100 cm3 суспензия от 4-10 g спори. Семената се държат в суспензия за 15 минути, като три пъти се разклаща старателно сместа. След това семената се поставят в марлеви торбички, оставят се да се отцедят с вода и се инкубират за 24 часа при 20 ° С. След изсушаване семената се засяват.

Овесените семена, които са замърсени с кифлички, с отстранени филми се покълват в кутии при 25 почвена влага и температура 20 ° С. След появата им те се трансплантират в полето. Същият метод Е. Е. Гешеле (1964 г.) препоръчва употребата в случай на изкуствено заразяване на ечемик със смърч и патоген на ивица хелминтоспориоза.

При инокулиране (shtambov) овощни дървета върху кората след 1-1,5 cm се прилагат две напречни срезове, между които кората се нарязва в средата в надлъжна посока, огъвайки крилата си, прави няколко плитки разрези на дървесина и въвежда културата на изследвания патоген заедно с парче агарова среда. Тогава кортикалните клапи се затварят и мястото на инфекция се покрива с пластмасова обвивка или пергамент, като се закрепват краищата с канап или канална лента. Когато използвате хартия, под превръзката се поставя навлажнено парче памучна вата..

В случай на инфекция на скелетните клони с патогени, които могат да се развият само в преди това отслабени тъкани, последните се приживяват в близост до мястото на инокулация.

В случай на изкуствено заразяване на дървесни видове с паразити по избор (гъбички от рода Cytospora и др.) експериментите се правят най-добре в лабораторни условия върху отрязани издънки. За целта от изпитвания сорт се изрязват издънки, издънки с дължина 150 мм и дебелина около 10 мм в количество 20 бр. (10 броя за опит и контрол). След това на разстояние 50 мм от горната част на издънката се прави разрез на дълбочина до 5 мм - след повърхностна стерилизация в него се поставя агарова среда с гъбичен мицел. Мястото на инокулация се затяга с пластмасова обвивка, която се фиксира в краищата с нишки или изолационна лента. На обратната страна на издънката памукът се поставя под филма, който, ако е необходимо, периодично се навлажнява с инжекция със спринцовка през филма.

Резниците се поставят в чаши с вода или с предварително калциниран мокър пясък. Намирайки се във вода или пясък, резниците започват да липсват минералите на почвата, жизнените им функции отслабват и те умират. Този процес отнема много време, което ви позволява да определите времето на заболяването на резници с различна степен на отслабване, следователно, патогенната способност на гъбичките и устойчивостта на растенията.

Заразените издънки се сравняват с контролните, като се използва порядъчен критерий X, обикновено в момента на смъртта на 2/3 от резниците от най-податливия сорт. В случай, че засиленото образуване на калус ще премине по краищата на раната, раната се почиства и се извършва вторична инокулация, без да се прекъсва експериментът.

Дървеният разсад може да се инокулира чрез въвеждане на инфекцията в стъблото с помощта на медицинска спринцовка. Можете да направите инфекциозно начало в корените директно в почвата, като ги повредите с метална пръчка (в получената рана се въвеждат патогенни спори).

Инокулирането на плодовете и кореноплодите се извършва чрез прилагане на суспензия от патогенни спори върху стерилната им повърхност. В този случай можете също да използвате сухи спори, пробиващи или нарязващи кожата на плода или да инжектирате водна суспензия от спори (1 капка) със спринцовка под кожата. Понякога инфекцията се въвежда в дълбоко изрязване на кореновата култура, след което се вмъква отрязаната част на първоначалното й място.

Най-често инокулумът се прилага върху почвата, за да създаде инфекциозен фон, без да повреди кореновите системи - гъбата първо се размножава на специална среда.

За много години работа с широк спектър от растителни видове и сортове се използват различни инфекциозни фонове. Те могат да бъдат естествени и изкуствени, а също да варират в степента на проявление на болестта (слаба, силна).

При създаване на инфекциозен фон в почвата, например, причинители на памучно увяхване, чистите гъби култури първо се отглеждат в колби със стерилни овесени семена (100 зърна на 100 см3 вода). След това културите се размножават в бутилки със среда със същия състав. На всеки 100 м2 площ се прилага 3-4 кг култура (друг метод е описан по-долу).

Въвеждането на гъбични култури в почвата се използва и при работа с патогените на увяхване (увяхване) на патладжан и пипер - склеротията на патогените се използва по време на пъпката на растенията с предварително увреждане на корените.

Извършва се инокулация на разсад на ечемик и пшеница от причинителите на хелминтоспориоза, фузариум, офхиоболез и други патогени, като се въвежда култура на гъби в семенните редове заедно със семената. Използват се чисти култури от гъби, отглеждани на зърнени или агарни среди (0,5 нишесте, 0,02 KH2P04, 0,02 Са (N03) 2 0,02 пептон и 2 агар агар). Използва се и заразена сламена секция. Редовете по време на сеитбата се покриват със заразена слама със скорост 20 смачкани растения, смесени с 1 кг хумус на 25 м сеитбена редица (Е. Е. Гешеле, 1964 г.).

Когато създавате инфекциозен фон от патогени на снежна плесен, смес от щамове (Fusarium НИВale, Typhula incarnata и др.), които предварително се отглеждат върху подкиселен картофен агар и след това се размножават върху стерилен овес. Преди да въведат културата на гъбите в почвата, те се смесват със земята в равни количества и се разпределят равномерно по повърхността на парцела. Инфекцията се въвежда в почвата през есента със скорост 200 г култура върху овес на 1 м2. Замърсената почва се покрива отгоре с 1-1,5 см слой земя.Първата година на инфекциозен фон се извършва разузнавателна сеитба. Ако в същото време екскрецията на растението от патогени е равномерна, през следващата година сюжетът се използва за експерименти (В. К. Неофитова, Н. А. Новик, 1969).

Ленен лен ръжда инфекциозен фон (Melampsora ЛиНи) създават с помощта на линч слама, засегната от причинителя на болестта (смес от сортове). Такава слама (стъбла) се полага през есента под снега. През пролетта засегнатите стъбла се държат във вода 2-3 часа и се проверява покълването на телетоспорите, покълвайки ги на 50-100 сегмента от стъблата във влажна камера. Покълналите спори се броят 48 часа след поставянето им във влажна камера.

Първият метод е приложим при изследване на биологията на патогена и инокулирането на единични растения, вторият - при полевата оценка на сортовете.

При създаване на инфекциозен (провокиращ) фон за причинителя на вертицилин вилат от памук върху парцела през първата година, растителните остатъци, засегнати от гъбата (guza-pai), се миришат и обилно се поливат. На следващата година се извършва изравняваща сеитба на памук, чувствителен към това заболяване, след прибирането на реколтата засегнатите растителни остатъци отново се надушват. Еквалайзерната сеитба също е необходима, за да се провери надеждността на провокативния фон. Само след такава проверка може да се счита, че е подготвен за тестване на сортовете.

Ленена инфекция с антракноза (Colletotrichum lini), извършена чрез въвеждане на инфекция в почвата и пръскане на разсада със спорна суспензия. Като инфекциозен материал се използват засегнатата ленена слама и разсад, както и чиста патогенна култура, отглеждана върху овес и пивен агар. За да се зарази почвата, в горната част на почвата се вграждат чиста гъбична култура, болен разсад и ленена слама. Вегетативните растения се инокулират със спорна суспензия във фазата на разсад (Т. В. Крилова, Ю. Т. Карпунина, 1969).

При заразяване с бяло гниене на слънчоглед (Sclerotinia Лиbertiana) се прилага метод, при който едновременно със семената, 2-3 малки склероции на причинителя на патогена на болестта се въвеждат във всяко гнездо с помощта на ръчна машина за засаждане. Посоченият метод ви позволява да получите признаци на заболяването на базалната част на стъблото (А. I. Лукашевич, 1969 г.).

Увеличение на запасите от брашнеста мана от слънчоглед (Plasmopara helianthi) се извършват, както следва. Първо се приготвя зооспорна суспензия, за която засегнатите листа и слой от мокра филтърна хартия се поставят във влажни камери. Мокрите камери се поддържат при температура 16-20 ° C. Узрелите конидии се отстраняват от повърхността на листата с бръснач или мокър тампон и се приготвя суспензия. Инокулирането на растенията се извършва чрез поддържане на суспензията на лепкавите семена в суспензия за 5-8 часа при температура 17-19 ° C. След това разсадът от слънчоглед се засажда в кутии с размери 50 × 40 × 15 см, оранжерии или открита земя. В кутии и котловини растенията се поставят по схемата: между редове 10-15, в ред 2-3 см - в открита земя - между редове 45-60 и в ред 3-5 см.

Причинителят на склеротиновата детелина се отглежда от склеротия върху филийки картофи във влажна камера. След това резени с развит паразит мицел се поставят под растенията в кореновата шийка.

По подобен начин се увеличава броят на инфекциите в почвата чрез многократно въвеждане на растителни остатъци, заразени с патогени на мана на слънчоглед, кореново и кореново гниене на пшеница и ечемик, кил, зеле, грахова аскохитоза и др..

Почвени патогени (гъбички при раждане Verticillium, Fusarium и др.) Плодовите и ягодовите култури се размножават предварително в чисти култури на хранителна среда. Обикновено зърнените зърна се използват като хранителен субстрат, които се заливат с вода в колби (приблизително в съотношение 1: 1) и се стерилизират в автоклав при налягане от 1 атм. След това в колбите със зърното се въвежда инфекция от съответната гъбичка и се инкубира в продължение на 10-15 дни с периодично разклащане, за да се смеси субстратът. В същото време семената на голите зърнени култури (пшеница, ръж, бобови растения) се смесват с плява или ситно нарязана слама, за да се избегне образуването на кашиста маса..

Степента на приложение на такава гъбна култура в почвата варира в зависимост от вида патоген и сорта на растенията. Като опора можете да вземете 3 кг култура да се прилага на 120 м2 насаждения от горски плодове или 1,5-2 кг на хранителна площ на едно дърво (в зависимост от схемата на засаждане).

По този начин, горните методи за инокулация на растения са много разнообразни, като някои промени са приложими за работа с почти всички фитопатогенни гъби върху голямо разнообразие от селскостопански растения..