Диагностични методи за вирусни и вирусни заболявания на растенията

Визуален метод за диагностика

В повечето случаи не е трудно да се определи вирусната природа на заболяването. Обикновено тя се определя от външни признаци, като линейни хлоротични шарки или пръстеновидни модели на младите листа. Идентифицирането им обаче често е трудно, тъй като вирусите имат асимптоматичен (латентен) характер на развитие. Симптомите зависят от състоянието на организма, агресивността на патогенния щам, условията на околната среда и продължителността на престоя на вируса или вируса в клетките на гостоприемника. Например, симптомите на заболяването са ясно изразени в растения, растящи на ярка светлина и при умерена температура, при висока температура и при слабо осветление, симптомите на заболяването може да не се изразяват изобщо.

Изясняването на вените на най-младите листа често е един от първите признаци на системна вирусна инфекция. Вените стават жълти и полупрозрачни. Листата, които се образуват по-късно, могат да бъдат мозаечни, петнисти или напълно жълти (хлоротични)..

Инкубационният период на заболяването зависи от вида на вируса, растението гостоприемник и условията на околната среда, но във всеки случай е няколко дни или седмици.

Ако първите симптоми на вируса са забележими при разсада, тогава източникът на инфекция е бил или в семената, или инфекцията е възникнала чрез носител. Ако заразените растения са разположени в културата напълно случайно или само в редове, засадени от една и съща партида, тогава това показва, че най-вероятно е бил заразен посадъчният материал. Ако в определени райони на полето се открият болни растения и появата на заразени зони се дължи на разликите в почвата, има всички причини да се предполага разпространението на вируси през почвата.

Трябва също да се отбележи, че има симптоми, характерни за вируса, но причинени от други причини (лезии от фитоплазми, някои бактерии и смучещи вредители). Симптоми, подобни на вирусна инфекция, често са причинени от нарушения в храненето с минерални вещества, като тези, свързани с недостиг на желязо (Фиг. 1). Различни деформации на органи могат да бъдат причинени от регулатори на растежа и хербициди от различно естество (Фиг. 2).

По този начин, използвайки метода на визуалната диагностика, точната идентификация по външни признаци на увреждане от вируси и вируси е невъзможна, ясен отговор може да се получи само с помощта на инструментални методи (ензимно свързан имуносорбентен анализ, PCR анализ и др.).

Метод на индикаторните растения

Метод на индикаторните растения - Това е много често срещан метод за диагностициране на вирусни и вирусни заболявания и идентифициране на техните патогени. Методът на растенията с индикатори се основава на използването на индикаторни растения, които в повечето случаи дават ясни и специфични симптоми, характерни за определен тип патоген. Билковите индикаторни растения са заразени чрез механична инокулация със сок, в резултат на това инфекцията може да се прояви като локална некроза, промяна в цвета и инхибиране на растежа.

За вируса на доматената аспермия като индикатор се използват младите тютюневи растения (Никотиана глутиноза), за диагностициране на картофен Х-вирус - сферичен амарант (Gomphrena globosa). За откриване на заразяване с домати с вирусоиди, вретеновидните клубени от картофени клубени използват скополия като показатели (Scopolia sinensis) или чувствителни сортове домат. В някои случаи отделни изолирани листа от индикаторни растения могат да се използват за инфекция. Сокоустойчивите вируси се присаждат на индикаторни растения по различни методи. В редки случаи за предаване на вируса се използват преносители на насекоми и растение за паразити.

Серологично диагностичен метод

Методът се основава на реакцията на утаяване (образуване на утайка) между специфични антитела и протеини (антигени) на патогена. Методът на серологична диагноза не е приложим за идентифициране на вирусоиди поради липсата на протеинов компонент, както и за редица вирусно-непоносими вируси със слаби имуногенни свойства. Следните модификации на серологичната диагностика могат да бъдат използвани за идентифициране на вируси в растение:

1) Ензимен имуноанализ (ELISA) - най-чувствителният метод, който ви позволява да получите количествени оценки. Тя се основава на специфичното разпознаване на повърхностните антигени на вируса от антитела в присъствието на ензими. Този метод се използва широко в практиката за идентифициране на посевни вируси, подходящ за серийни анализи.

2) Капков метод. Извършва се по следния начин. На стъклен слайд капка растителен сок се смесва с капка антисерум. След няколко минути реакцията се оценява под микроскоп при слабо увеличение в тъмно поле или дори визуално, без микроскоп.

3) Метод на двойна дифузия - провежда се в агар гел за определяне на сферични и други малки вируси. Извършва се по този метод, в някои кладенци, които се нарязват на слой от агарова среда, се добавя антисерум, а в други - пречистен растителен сок. В гела вирусни частици и антитела се дифундират един към друг, за да се срещнат и в точката на срещата образуват различни линии за утаяване в случай на тяхната допълваща специфичност.

4) Метод на радиална имунодифузия. Използвайки този метод, антисерумът се добавя директно към агаровата среда, докато кладенчетата се пълнят с растителен сок. Реакцията е положителна, ако около ямките се образуват пръстеновидни утайки..

5) Метод на адсорбция. Методът се основава на факта, че преди да реагира с антиген, антителата свързват някои инертен материал с големи частици, например, латекс. При реакция с антиген се получава ясно видима аглутинация на целия комплекс..

Метод на електронна микроскопия

На ултра тънки участъци от болните растителни тъкани с помощта на електронни микроскопи можете да определите структурата, формата и дори размера на вирусите или вирусоидите. Често се използва електронен микроскоп в комбинация със серологични методи (имуноелектронна микроскопия) и могат да бъдат открити вирусни частици със слоести антитела. Методът на електронна микроскопия се използва изключително рядко поради високата цена на оборудването и реагентите, трудността при изолиране на вируси и вируси, окисляване на растителни участъци и редица други фактори.

Метод на електрофореза

Този метод се основава на отделянето на предварително пречистени нуклеинови киселини на вирус (вироид) или неговите протеини в гел под въздействието на електрически ток, последвано от оцветяване на зоните. Методът на електрофореза ви позволява да определите масата и размера на вирусни или вирусни структури. Методът се използва широко за визуално изследване на крайния продукт на полимеразната верижна реакция. За да запишете резултатите, направете снимки на гела в предавана или отразена светлина.

Молекулярно-биологичните методи се основават на знанията за структурата на молекулата на РНК (ДНК) на вирус или вирусоид. Най-честият тест е амплификацията (размножаването) на специфични за видовете РНК последователности по време на полимеразната верижна реакция (PCR). Отделните РНК фрагменти, изолирани от изследваните растения, които са специфични само за един вид или род вируси, се умножават чрез ензими в присъствието на праймери (съответни олигонуклеотиди). Освен това броят им в крайния продукт на реакцията надхвърля първоначалния брой копия на избрания РНК фрагмент милиони пъти. След това вирусна РНК (ДНК) се открива чрез гел електрофореза или имунофлуоресценция. Методът се използва широко в практически вирусологични изследвания..

Методът на ДНК сондата също се основава на принципа на допълване на нуклеиновите киселини. Синтезират се специфични сонди, които хибридизират само със специфични нуклеотидни последователности на вирус или вирусна РНК. В зависимост от избора на сонди е възможно да се разграничат групи, видове и дори щамове на вируси и вируси.

Метод на включване

След развитието на вируси в растителните клетки се образуват струпвания от вирусни частици (включвания), наречени кристали на Ивановски, които се виждат с помощта на конвенционален светлинен микроскоп. Всеки вирус има своя собствена форма на вирусни включвания, които се образуват най-често в клетките на епидермиса на листата или в клетките на космите. Например вирусът на тютюневата мозайка има кристали с шестоъгълна форма и игла - картофеният Х вирус обикновено образува сферични аморфни тела. За откриване на вируса на зелена петна от мозайка от краставици, листа от картофи с усукване и някои други се използват химически аналитични методи за диагностика..